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Mar 27, 2023

La régulation complexe de la compétence chez Staphylococcus aureus dans des conditions microaérobies

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 6, Article number: 512 (2023) Citer cet article

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Pour effectuer une transformation naturelle, l'un des trois principaux mécanismes de transfert horizontal de gènes, les bactéries doivent entrer dans un état physiologique différencié appelé compétence génétique. Fait intéressant, de nouvelles bactéries présentant une telle aptitude sont souvent découvertes, et l'une des dernières est l'agent pathogène humain Staphylococcus aureus.

Ici, nous montrons un protocole optimisé, basé sur des cultures de cellules planctoniques, conduisant à un grand pourcentage de la population activant le développement de la compétence et une amélioration significative des efficacités de transformation naturelle de S. aureus. Profitant de ces conditions, nous réalisons des analyses transcriptomiques pour caractériser le régulon de chaque régulateur central de compétence. SigH et ComK1 sont tous deux essentiels pour l'activation des gènes de transformation naturelle, mais également importants pour l'activation ou la répression des fonctions périphériques. Même si ComK2 n'est pas jugé important pour le contrôle des gènes de transformation, son régulon montre un chevauchement important avec celui de SigH et ComK1. Enfin, nous proposons que les conditions microaérobies, détectées par le système à deux composants SrrAB, sont essentielles pour activer la compétence chez S. aureus.

Un organisme commensal hautement adaptatif, tel que Staphylococcus aureus, possède un éventail de gènes qui permet à la bactérie de se développer, d'infecter et de survivre dans une grande variété de niches écologiques. Les narines antérieures sont généralement considérées comme la niche écologique native de S. aureus, bien que la bactérie puisse être isolée d'autres zones du corps humain, notamment la peau, les aisselles, l'aine et le tractus gastro-intestinal1. Bien que la colonisation ne soit généralement pas nocive, S. aureus peut violer les défenses innées de l'hôte et accéder à des tissus plus profonds, provoquant une variété d'infections superficielles et invasives2. De plus, en tant qu'anaérobie facultatif, S. aureus a la capacité de se développer et de contrecarrer le système immunitaire de l'hôte en présence ou en l'absence d'oxygène. Cette capacité est particulièrement importante pour S. aureus car son environnement est connu pour être ou devenir anaérobie au cours d'une infection3,4.

En plus de ces pouvoirs adaptatifs remarquables, S. aureus est également devenu l'un des agents pathogènes les plus redoutés à l'hôpital en raison de l'émergence généralisée de souches multirésistantes aux antibiotiques5,6. Le transfert horizontal de gènes (HGT) de gènes de résistance aux antibiotiques provenant d'autres souches de S. aureus ou même d'autres genres a été considéré pendant des années comme exclusivement médié par la conjugaison et la transduction7. Cependant, il y a quelques années, la démonstration que S. aureus est capable de devenir naturellement compétent pour la transformation génétique8 a changé notre façon d'appréhender la HGT chez cet important pathogène humain.

La compétence est une adaptation physiologique que certaines espèces bactériennes développent en réponse à divers signaux environnementaux9. En réponse à ces stimuli, les cellules bactériennes déclenchent des voies de transduction du signal, activant finalement des régulateurs de compétence centraux. Toutes ces étapes sont contrôlées par les gènes dits de compétence précoce. Fait intéressant, les régulateurs de la compétence centrale ont été identifiés dans plusieurs organismes modèles comme des activateurs transcriptionnels10,11 ou des facteurs sigma alternatifs12. Une fois activés, ils initient l'expression des gènes de compétence tardive, parmi lesquels se retrouvent tous les gènes essentiels à la transformation génétique.

Il est important de noter que trois régulateurs potentiels de compétence centrale ont été identifiés chez S. aureus : le facteur sigma alternatif, SigH13, et deux régulateurs transcriptionnels, ComK1 et ComK214. De plus, il a été montré que S. aureus est capable d'induire naturellement la compétence dans un milieu chimiquement défini appelé CS28. Les auteurs ont détecté un maximum de 1,6 % de cellules induisant la compétence après 8 h de croissance dans le milieu CS2, conduisant à des efficacités de transformation atteignant à peine la limite de détection (autour de 10−10) pour une souche sauvage8.

Dans cette étude, notre objectif principal était de caractériser le développement de la compétence chez l'agent pathogène humain S. aureus. Notre objectif était d'étudier toutes les étapes impliquées, depuis les stimuli environnementaux détectés par les cellules et les voies de transduction du signal jusqu'aux régulateurs centraux de compétence et leurs régulons. Pour atteindre ces objectifs, nous avons d'abord développé un protocole pour optimiser le développement de la compétence et la transformation génétique dans les cultures planctoniques de S. aureus. Ensuite, à l'aide de diverses souches rapporteurs et d'une analyse transcriptomique globale, nous avons analysé le rôle des trois régulateurs centraux lors du développement de la compétence chez S. aureus. Nous avons notamment montré que si SigH et ComK1 sont tous deux essentiels à l'expression des gènes impliqués dans la transformation génétique, les trois régulateurs (SigH, ComK1 et ComK2) sont tous nécessaires au développement complet du programme de compétence transcriptionnelle. Enfin, nous proposons que la limitation en oxygène, détectée par le système à deux composants SrrAB (TCS), activant probablement SigH, contrôle le développement de la compétence chez l'agent pathogène humain S. aureus.

Nous avons d'abord décidé d'optimiser le protocole publié par Morikawa et ses collègues en 20128 (voir Matériel et méthodes pour plus de détails). Afin de comparer nos résultats, nous avons utilisé la même souche reporter, exprimant le gène gfp sous le contrôle du promoteur de l'opéron de compétence tardive comG (PcomG-gfp)8. En bref, la souche reporter a d'abord été striée sur une plaque d'agarose BHI. Les colonies isolées sont ensuite utilisées pour ensemencer une pré-culture dans le milieu BHI. Cette pré-culture a ensuite été rapidement stoppée en croissance exponentielle, centrifugée, lavée, et utilisée pour ensemencer une nouvelle culture dans un milieu CS2. A partir de cette culture initiale dans du CS2 frais, des dilutions en série au 1/10 ont été réalisées dans des tubes Falcon fermés. Enfin, la densité cellulaire (OD600 nm) et le pourcentage de cellules compétentes exprimant la GFP ont été mesurés par cytométrie en flux dans chaque culture diluée toutes les 30 min. Fait intéressant, les Fig. 1a, b montrent comment notre protocole optimisé a pu induire le développement de compétences jusqu'à 70 % de la population dans une expérience donnée (en réalité, l'analyse statistique a évalué ce pourcentage à 52 ± 15 % de la population, n = 12). Ce pourcentage, plus de dix fois plus élevé que dans la littérature, était auparavant calculé grâce à la détection de cellules exprimant la GFP par microscopie8. Par conséquent, nous avons vérifié que les mesures effectuées par cytométrie en flux n'introduiraient aucun biais et fourniraient des résultats similaires à la microscopie (Fig. 1 supplémentaire).

a Croissance d'une souche sauvage exprimant la gfp sous le contrôle du promoteur comG (St29) en milieu CS2, entre 16 et 21,5 h. Les dilutions de 10−2 à 10−5 sont indiquées. La dilution 10-2 était déjà en phase stationnaire, tandis que la dilution 10-3 entrait en phase stationnaire après 16 h de croissance. Les dilutions 10-4 et 10-5 étaient respectivement en phase exponentielle tardive et précoce au début de l'expérience. Toutes les dilutions ont atteint une DO finale similaire entre 2,4 et 2,6. b Le pourcentage de cellules compétentes a été mesuré par cytométrie en flux en analysant le pourcentage de cellules exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur comG (PcomG). Dans chaque culture diluée présentée dans le panneau a), le pourcentage de cellules compétentes exprimant la GFP a augmenté dans la phase exponentielle tardive et a atteint un maximum à l'entrée dans la phase stationnaire. Ce graphique montre une expérience représentative qui a été répétée trois fois (répliques biologiques, voir Fig. 2a supplémentaire). c Efficacité de transformation des souches mutantes de type sauvage (N315ex sans Phi), comGA (St137), sigH (St45), comK1 (St37), comK2 (St38) et srrA (St117) en utilisant des plasmides (pCN34, KanR, barres blanches ) ou ADN chromosomique (barres grises) (voir Matériel et méthodes pour plus de détails). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± ET. Pour chaque souche, l'expérience a été répétée au moins cinq fois (répliques biologiques). Les expériences individuelles sont représentées par des cercles bleus. d Efficacité de transformation des souches de laboratoire (N315, RN4220 et USA300) et des isolats cliniques de SARM (NL10, NL27) ou MSSA (NL36) à l'aide d'ADN chromosomique (barres grises) (voir matériel et méthodes pour plus de détails). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± ET. Pour chaque souche, l'expérience a été répétée au moins cinq fois (répliques biologiques). Les expériences individuelles sont représentées par des cercles bleus.

Nous avons ensuite confirmé que notre protocole optimisé, associé à un meilleur développement des compétences, conduisait également à des efficacités de transformation plus élevées. Fait intéressant, dans des conditions de laboratoire, une souche de type sauvage N315 a atteint une efficacité de transformation d'environ 1, 5 × 10−7 (± 0, 6 × 10−8) avec un plasmide réplicatif comme ADN donneur (Fig. 1c). Un tel résultat est 1000 fois supérieur à ce qui a été publié précédemment8. Fait important, l'efficacité de la transformation a même atteint 4, 2 × 10−6 (± 4, 1 × 10−6) lorsque nous avons utilisé un chromosome de la souche S. aureus (portant un marqueur antibiotique, voir Matériel et méthodes) comme ADN exogène (Fig. 1c). Pour confirmer définitivement que les colonies qui se développaient dans nos tests étaient de vrais transformants, nous avons également montré qu'aucun événement de transformation ne pouvait être détecté en utilisant une souche dans laquelle comGA, un gène essentiel à la transformation génétique15, était délété (Fig. 1c).

Il est important de noter que le protocole décrit ici et optimisé pour la souche N315 conduit également d'autres souches de laboratoire (RN4220 et USA300) et des isolats cliniques (NL10, NL27 et NL36) à la transformation génétique (Fig. 1d). Fait intéressant, RN4220 a affiché des efficacités de transformation très élevées (atteignant 9,7 × 10−5 ±5,9 × 10−5) tandis que USA300 (7 × 10−8 ±6,9 × 10−8) et les isolats cliniques (NL10, 1,2 × 10−7 ± 3,79 × 10−7 ; NL27, 1,6 × 10−7 ±4,8 × 10−7 et NL36, 1,2 × 10−7 ±7,9 × 10−7) ont montré des nombres inférieurs à N315. Ces résultats démontrent clairement la robustesse de notre protocole, mais aussi qu'une optimisation supplémentaire pourrait être nécessaire pour de nouvelles souches.

La figure 1 montre clairement comment la compétence a été induite dans chaque culture diluée en utilisant notre protocole optimisé. Chaque dilution supplémentaire était caractérisée par un retard de croissance de 2 h (Fig. 1a). En effet, la dilution 10-5 a besoin de plus de temps pour atteindre la phase stationnaire que la dilution 10-4, qui a besoin de plus de temps que la dilution 10-3. En conséquence, le développement de la compétence a également été retardé dans chaque culture diluée consécutive (Fig. 1b). Cependant, les cellules compétentes exprimant la GFP apparaissaient toujours lorsque les cultures approchaient la DO = 2 et atteignaient un maximum une fois que chaque culture est entrée dans la phase stationnaire (Fig. 1a, b).

Pour vérifier davantage l'existence d'une corrélation entre le développement des compétences et la densité cellulaire, nous avons répété cette expérience trois fois (Fig. 2a supplémentaire). Cette corrélation a clairement montré que le développement de la compétence chez S. aureus cultivé en CS2 atteignait un maximum lorsque les cultures entraient dans la phase stationnaire avec une DO600nm d'environ 2,4 (en fait entre 2,2 et 2,6) (Fig. 2a supplémentaire). Une densité cellulaire élevée, détectée par les cellules bactériennes via le quorum sensing (QS), a été proposée et vérifiée dans plusieurs organismes modèles comme un stress important, induisant la compétence16,17,18. Par conséquent, nous avons alors émis l'hypothèse qu'un système QS pourrait être impliqué dans le développement de la compétence chez S. aureus. Fait intéressant, deux systèmes QS ont été identifiés chez S. aureus (Agr et Lux19). Ainsi, nous avons enfin étudié l'impact de la délétion des gènes agrA (codant pour le régulateur transcriptionnel du système Agr,19) et luxS (codant pour le régulateur du système Lux,19) sur le développement de la compétence. Étonnamment, aucun de ces gènes n'a été trouvé impliqué dans l'induction de l'expression de l'opéron comG (Fig. 2b supplémentaire). Ce résultat semblait surprenant, surtout lorsqu'on le compare à des données récentes où la suppression d'agrAC diminuait la compétence d'un facteur triple20. Même si les protocoles utilisés dans cette étude sont différents des nôtres, des investigations supplémentaires seront nécessaires pour comprendre pourquoi QS ne semble pas impliqué dans toutes les conditions.

Comme mentionné dans l'introduction, trois régulateurs de compétence potentiels ont été identifiés dans la littérature. Même si SigH s'est avéré important pour activer l'expression de PcomG8, aucun rôle n'a été clairement attribué à ComK1 et ComK2. Ici, en utilisant notre protocole optimisé, nous avons décidé de tester l'effet de la suppression de sigH, comK1 et comK2 sur l'expression de quatre promoteurs : PcomG (un promoteur uniquement activé par la surexpression de SigH,8,14), Pssb (un promoteur qui ne pouvait que être activés par la surexpression de ComK1,14), PcomC et PcomF (deux promoteurs qui ne pouvaient être activés par aucun régulateur14).

Comme prévu, dans un contexte de type sauvage, les quatre promoteurs ont été trouvés activés avec un pourcentage moyen de cellules exprimant la GFP de 51,87 % pour PcomG, 77,26 % pour Pssb, 38,32 % pour PcomC et 38,56 % pour PcomF (Fig. 2 et Figure supplémentaire 3). Lorsque sigH a été supprimé, seule l'expression de PcomG a été perdue (Fig. 2a). Ce résultat confirme que SigH ne contrôle pas l'expression de tous les gènes de transformation génétique et qu'au moins un régulateur supplémentaire doit être impliqué. Fait intéressant, lorsque comK1 a été inactivé, l'expression de tous les promoteurs a été abolie (Fig. 2a – d). ComK1 est donc indispensable, aux côtés de SigH, pour l'expression de l'opéron comG mais est aussi absolument nécessaire, seul, pour l'expression de ssb et comC. Fait intéressant, la régulation de comF semblait intermédiaire, car la suppression de comK1 abolit l'expression de comF tandis que l'absence de sigH la diminue d'un facteur presque double (Fig. 2d). Enfin, dans un mutant comk2, aucun effet n'a pu être détecté pour tous les promoteurs.

Pourcentage de la population exprimant la GFP sous contrôle de PcomG (St29, St51, St40 et St 41) (a), Pssb (St50, St61, St64 et St67) (b), PcomC (St48, St60, St63 et St66 ) (c) et PcomF (St233, St235, St234 et St236) (d) dans un contexte de type sauvage ou en l'absence de sigH, comK1 ou comK2 a été déterminée après 21 h de croissance dans un milieu CS2. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± ET. Chaque expérience a été répétée au moins cinq fois (répliques biologiques). Les expériences individuelles sont représentées par des cercles bleus.

Pour compléter nos résultats (Fig. 2) et caractériser de manière exhaustive les régulons SigH, ComK1 et ComK2, nous avons ensuite réalisé une analyse transcriptionnelle globale par séquençage d'ARN en comparant l'impact de la délétion des gènes codant pour ces trois régulateurs individuels sur la compétence programme transcriptionnel.

Tout d'abord, nous nous sommes concentrés sur les gènes impliqués dans la transformation génétique naturelle (Fig. 3 et Tableau supplémentaire 1). Les résultats précédemment obtenus ont été confirmés malgré quelques petites différences (discutées dans la note complémentaire 1). Dans l'ensemble, SigH et ComK1 se sont avérés essentiels pour l'expression de la plupart des gènes de transformation génétique, à l'exception de ssb, qui n'est contrôlé que par ComK1. Encore une fois, aucun rôle n'a pu être attribué à ComK2. Enfin, nous avons vérifié l'efficacité de transformation des souches où les gènes codant pour les régulateurs centraux de la compétence ont été délétés individuellement (Fig. 1c). Comme on pouvait s'y attendre, seule l'absence de sigH ou de comK1 abolissait la transformation génétique, tandis qu'un mutant comK2 présentait une efficacité de transformation comparable à celle d'une souche de type sauvage (Fig. 1c).

Gènes de compétence tardive dont l'expression est induite (>2 fois, a) ou réprimée (>2 fois, b). Chaque cercle coloré représente un régulon, dont l'expression est activée ou inhibée par SigH (en bleu), ComK1 (en jaune), ComK2 (en vert), ou par les trois (en dehors du cercle noir). Le nombre de gènes dans chaque catégorie est indiqué à l'intérieur des cercles ou à l'intersection entre les cercles lorsque le même gène est contrôlé par plus d'un régulateur. Le tableau ci-dessous montre le nombre total de gènes dont l'expression est induite ou réprimée par un facteur double, triple ou quintuple. Les gènes de compétence tardive activés (c) et réprimés (d) (> 2 fois) sont également présentés par fonction. Le nombre de gènes contrôlés par chaque régulateur de compétence central (SigH en bleu, ComK1 en jaune et ComK2 en vert) est indiqué à l'intérieur des cercles ou à l'intersection entre les cercles lorsque le même gène est contrôlé par plus d'un régulateur.

Dans d'autres organismes modèles, le programme transcriptionnel de compétence englobe toujours plus de gènes que les seuls gènes impliqués dans la transformation génétique21,22,23,24. C'est clairement aussi le cas chez S. aureus. En effet, par rapport aux souches mutantes sigH, comK1 et comK2, les gènes 213/73/95 ont été respectivement surexprimés par au moins un facteur double dans la souche de type sauvage (Fig. 3a). De plus, si l'on considère des seuils de surexpression plus élevés, le nombre de gènes surexprimés reste important, avec 84/38/53 gènes surexprimés par un facteur triple et même 35/23/31 gènes surexprimés par un facteur quintuple. . Les nombres trouvés ici, en particulier pour le facteur d'expression triple, sont assez similaires à ce qui a été décrit dans un autre organisme modèle21,22,23,24, révélant un véritable ensemble de base d'environ 100 gènes de compétence tardive chez S. aureus.

Nous avons ensuite analysé les fonctions associées aux gènes induits au cours du programme transcriptionnel de compétence de S. aureus (Fig. 3c, Tableaux supplémentaires 2 à 4). En plus des gènes de transformation génétique naturelle, nous avons trouvé des gènes impliqués dans (i) la régulation de la réponse au stress (principalement mais pas exclusivement contrôlée par ComK2), (ii) des gènes codant pour de multiples systèmes putatifs Toxine/Antitoxine25 (contrôlés par les trois régulateurs ), (iii) des gènes impliqués dans le métabolisme des acides aminés et nucléiques (contrôlés par SigH et ComK2) et (iv) des gènes impliqués dans le transport du fer (principalement mais pas exclusivement contrôlés par SigH). Fait important, nos résultats ont clairement établi que même si seuls SigH et ComK1 sont essentiels à l'expression des gènes de transformation génétique, les régulateurs de la compétence centrale (c'est-à-dire SigH, ComK1 et ComK2) sont tous absolument nécessaires au développement complet de la compétence transcriptionnelle. programme dans S. aureus.

Notre analyse transcriptionnelle globale a également révélé que l'expression de nombreux gènes était inhibée lors du développement de la compétence chez S. aureus. En effet, nous avons constaté qu'un total de 399 gènes étaient inhibés (> 2 fois) dans la souche de type sauvage par rapport aux souches mutantes individuelles sigH, comK1 ou comK2 (Fig. 3b). Cela représente plus de 15% de tous les gènes présents dans le génome N315 de S. aureus.

Fait intéressant, plus de 10% des gènes réprimés (37 pour être exact) sont directement impliqués dans la virulence ou la régulation de la virulence (Fig. 3d, Tableau supplémentaire 5). Parmi ces gènes ont été trouvés de nombreux facteurs de virulence bien caractérisés, dont les gènes codant pour la capsule (CapA-O), les sérine protéases (SplA-F, SspA-C), les adhésines intercellulaires (IcaAB), les exoprotéines (Hlg, Coa), les protéines (ClfAB, fnb, FnbB, geh, sdrCD, Spa) et une lipase (Geh). De plus, l'expression d'un important TCS connu pour piloter l'expression de plus de 20 facteurs de virulence in vivo, saeRS26, s'est avérée réprimée pendant la compétence. Même si tous les régulateurs de la compétence centrale se sont avérés impliqués dans la répression de la virulence, SigH et ComK2 ont joué un rôle majeur avec un chevauchement important entre les gènes qu'ils répriment chacun (Fig. 3d, Tableau supplémentaire 5). Malheureusement, une comparaison des exoprotéomes mutants de type sauvage et sigH ou comK2 n'a montré aucune différence significative dans le nombre de facteurs de virulence (Fig. 4 supplémentaire). Fait important, dans nos cultures, deux populations coexistent, les cellules compétentes et non compétentes, chacune représentant 50% de la population totale. Par conséquent, comme les cellules non compétentes produisent encore des facteurs de virulence, l'effet de l'inhibition associée aux cellules compétentes sur la quantité totale de facteurs de virulence produits dans la culture serait sous-estimé. Alternativement, les cellules auraient pu être collectées à un moment qui pourrait ne pas être approprié pour observer l'effet sur l'exoprotéome.

Enfin, le développement des compétences chez S. aureus a été démontré dans différentes conditions associées à différentes disponibilités en oxygène8. Ainsi, nous nous sommes demandé si les TCS sensibles à l'oxygène présents chez S. aureus (c'est-à-dire SrrAB27, NreBC28 et AirRS29) étaient impliqués au cours des premières étapes de régulation de la compétence au cours de la croissance planctonique dans le milieu CS2. Pour tester une telle hypothèse, nous avons comparé l'expression du promoteur comG dans les souches mutantes de type sauvage et srrA, nreC et airR. Dans cette expérience, la suppression de nreC et airR n'a pas affecté l'expression du promoteur comG (Fig. 4a). Cependant, lorsque srrA était absent, l'expression de comG était diminuée d'un facteur sept (Fig. 4a). Étant donné que SigH et ComK1 sont tous deux impliqués dans l'expression de l'opéron comG (Fig. 2a), nous avons ensuite décidé de déterminer quel régulateur de compétence central était sous le contrôle de SrrAB. Comme l'expression de ssb n'a été trouvée contrôlée que par ComK1 (Fig. 2b), nous avons finalement testé l'effet de la suppression de srrA sur son expression. En l'absence de srrA, l'expression de ssb n'a pas été affectée (Fig. 4b). De plus, la suppression de sigH et de srrA a eu le même impact sur l'expression de ssb que les souches mutantes individuelles de sigH et srrA (Fig. 4b). Au total, ces résultats suggèrent que SrrAB pourrait activer SigH pour contrôler l'expression du promoteur comG. De plus, l'implication de SrrAB dans les voies de régulation menant au développement des compétences et à la transformation génétique implique que l'absence de srrA doit avoir un effet sur l'efficacité de la transformation génétique de S. aureus. En effet, lorsque le gène srrA a été délété, une diminution de 15 et 19 fois (respectivement obtenue à l'aide d'ADN plasmidique ou chromosomique) de l'efficacité de transformation génétique de S. aureus a été observée (Fig. 1c).

a Pourcentage de cellules exprimant la GFP à partir de PcomG dans les souches mutantes de type sauvage (St29), ssrA (St145), nreC (St158) et airR (St177). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± ET. Chaque expérience a été répétée au moins cinq fois (répliques biologiques). Les expériences individuelles sont représentées par des cercles bleus. b Pourcentage de cellules exprimant la GFP de Pssb dans les souches de type sauvage (St50), srrA (St147), sigH (St61) et srrA/sigH double mutant (St252). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± ET. Chaque expérience a été répétée au moins cinq fois (répliques biologiques). Les expériences individuelles sont représentées par des cercles bleus.

Le TCS à détection d'oxygène permet à S. aureus de surveiller et de répondre aux conditions microaérobies ou anaérobies. En particulier, SrrAB s'est avéré être un régulateur global des facteurs de virulence dans des conditions de faible teneur en oxygène27. Il est donc tentant de supposer que lors de la croissance de S. aureus dans le milieu CS2, la concentration en oxygène a chuté dans la culture. Pour tester cette hypothèse, nous avons finalement mesuré la concentration d'oxygène dissous tout au long de la croissance dans CS2 (Fig. 5 et Fig. 5 supplémentaire). Fait intéressant, lorsque la DO a commencé à augmenter, la concentration en oxygène a rapidement chuté. En effet, alors que la concentration en oxygène restait constante à 21 % pendant les 8 premières heures, elle diminuait ensuite jusqu'à 0,27 % pendant les 6 h suivantes, alors que la DO de la culture n'atteignait que 0,5. Quelques minutes après que la concentration en oxygène a atteint son point le plus bas, la culture s'est arrêtée de manière reproductible pendant environ 1 h, potentiellement pour s'adapter à ces nouvelles conditions de faible teneur en oxygène (Fig. 5). Enfin, suite à la baisse de la concentration en oxygène et à la pause de croissance, des cellules compétentes exprimant la GFP ont commencé à émerger (Fig. 5). Par conséquent, nous pouvons proposer en toute confiance qu'en utilisant notre protocole optimisé, la croissance dans le milieu CS2 est associée à une limitation rapide de la disponibilité d'oxygène, conduisant à des conditions microaérobies détectées par SrrAB qui à son tour active SigH pour l'induction de compétence chez S. aureus.

Une souche de type sauvage (St29) exprimant la GFP sous le contrôle de PcomG a été cultivée dans un milieu CS2 pendant 24 h. Lorsque la croissance est devenue détectable, la concentration en oxygène, le pourcentage de cellules exprimant la GFP et la DO600 nm ont été mesurés toutes les 30 min. Au fur et à mesure que la DO augmentait, la concentration d'oxygène tombait rapidement de 21% à 0,27%, tandis que la DO n'atteignait que 0,5. Surtout, notre test nous permet d'affirmer que les conditions anaérobies complètes ne sont pas atteintes car nos capteurs sont capables de mesurer avec confiance des concentrations d'oxygène dix fois plus faibles. Quelques minutes plus tard, la croissance a marqué de manière reproductible une pause, probablement nécessaire pour que les cellules s'adaptent à des conditions de faible teneur en oxygène, ce qui a induit à son tour une augmentation du pourcentage de cellules compétentes exprimant la GFP. Cette figure montre une expérience représentative qui a été reproduite cinq fois (voir la Fig. 5 supplémentaire pour les répétitions).

Auparavant, les travaux de Fagerlund et ses collègues14 avaient clairement établi que la surexpression individuelle ou combinée du régulateur central de la compétence n'était pas suffisante pour induire le plein développement de la compétence chez S. aureus. Dans cette étude, nous présentons un protocole optimisé permettant l'induction optimale de la compétence génétique chez S. aureus. Ce protocole était essentiel pour mener à bien l'étude génétique proposée ici. Il est important de noter que les efficacités de transformation résultantes détectées avec plusieurs souches de laboratoire et isolats cliniques démontrent finalement le véritable potentiel de ce mécanisme HGT pour moduler la plasticité génétique de S. aureus et l'acquisition de gènes de résistance aux antibiotiques in vivo.

De plus, nous avons également établi que trois régulateurs de compétence centraux sont essentiels pour un développement complet du programme transcriptionnel de compétence chez S. aureus. Alors que l'importance de SigH était déjà connue, nous démontrons pour la première fois l'essentialité de ComK1 pour l'expression des gènes impliqués dans la transformation génétique. Fait important, nous révélons également comment ComK2 est impliqué, aux côtés de SigH et ComK1, dans le développement complet du programme transcriptionnel de compétence (Fig. 6). En effet, notre étude transcriptomique globale montre clairement qu'en plus de la transformation génétique, de nombreuses autres fonctions sont également induites lors de la compétence, une caractéristique partagée avec d'autres organismes modèles. Il sera important d'étudier à l'avenir comment ces autres processus biologiques (réponse au stress30, métabolisme des acides aminés31 et nucléiques32 ou systèmes toxine/antitoxine33,34) participent à l'établissement de la compétence d'adaptation environnementale.

Trois régulateurs de compétence centrale ont été identifiés, à savoir SigH, ComK1 et ComK28,14. Les trois régulateurs sont essentiels pour un développement complet du programme transcriptionnel de compétence. Alors que SigH et ComK1 sont absolument nécessaires à l'expression des gènes de transformation génétique, ComK2 (aux côtés de SigH et ComK1) est également essentielle pour l'induction de fonctions cellulaires supplémentaires (c.-à-d., réponse au stress, systèmes toxine/antitoxine, métabolisme des acides aminés et nucléiques, fer transport…). De plus, le développement de la compétence est caractérisé par l'inhibition de la virulence, principalement contrôlée par SigH et ComK2. Enfin, nous avons montré que le développement naturel de la compétence est induit par la diminution drastique de la concentration en oxygène dans la culture. Cette raréfaction de l'oxygène est probablement détectée par le système à deux composants SrrAB, qui à son tour active le régulateur central de compétence SigH.

La présence et l'implication de trois régulateurs de compétence centrale chez S. aureus, chacun probablement induit par des voies de transduction de signal distinctes, est une caractéristique frappante. Le chevauchement des régulons SigH, ComK1 et ComK2 en est un autre, même si un tel chevauchement a déjà été décrit chez Vibrio cholerae, chez qui deux régulateurs à compétence centrale ont été identifiés35. Une hypothèse pourrait être que S. aureus a besoin de plusieurs voies de régulation afin d'intégrer un plus large éventail d'indices pour décider de devenir ou non compétent pour la transformation génétique. Selon cette hypothèse, plusieurs signaux environnementaux devraient être présents de manière concomitante pour permettre le développement optimal de la compétence génétique chez S. aureus. D'autre part, une régulation globale aussi complexe fournit de multiples cibles pour moduler le développement des compétences lorsque S. aureus n'est pas dans ces conditions optimales. De manière intéressante, ComK2, qui ne contrôle pas l'expression des gènes de transformation génétique dans les environnements microaérobies, pourrait s'impliquer en réponse à différents signaux environnementaux spécifiques, complexifiant la régulation du développement de la compétence chez S. aureus.

De plus, il est intéressant de mentionner que la régulation du développement de la compétence chez S. aureus partage des traits avec plusieurs organismes modèles historiques importants : S. pneumoniae et son facteur sigma alternatif (ComX), phylogénétiquement proche de SigH13, B. subtilis et sa compétence centrale régulateur, ComK, homologue de ComK1 et ComK214 et V. cholerae par la présence de plusieurs régulateurs de compétence centrale18. Ainsi, il serait intéressant et probablement important de tester à l'avenir si d'autres caractéristiques de régulation présentes dans ces organismes modèles historiques pourraient également être utilisées par S. aureus pour contrôler ou moduler le développement de la compétence.

Enfin, nous démontrons comment la limitation en oxygène, conduisant à des conditions microaérobies détectées par le SrrAB TCS, contrôle le développement de la compétence chez S. aureus. Comme nos cultures sont réalisées en tubes fermés, à l'instar de ce qui a été publié précédemment36, nous pensons que la culture de S. aureus dans CS2 entraîne une consommation rapide d'oxygène dissous qui ne peut être remplacé par l'oxygène atmosphérique. Les résultats de la littérature indiquaient déjà que S. aureus avait la capacité d'induire la compétence sous différentes concentrations d'oxygène8,20. L'induction de compétence dans des conditions anaérobies8, lors de la formation de biofilm20 ou en réponse à des ROS37, renforce encore cette idée. Nous avons également proposé que SrrAB puisse activer SigH (par transcription, traduction ou stabilité) en réponse aux variations de la concentration en oxygène de l'environnement. Des travaux supplémentaires seront nécessaires pour bien comprendre comment une diminution de la concentration en oxygène active, directement ou indirectement, SigH via SrrAB. Fait intéressant, les travaux de Cordero et ses collègues montrent comment le développement des compétences est associé à des changements spectaculaires du métabolisme du carbone37. Il serait donc important de tester si la régulation de la physiologie cellulaire, en réponse aux limitations d'oxygène, pourrait être impliquée dans le développement de la compétence chez S. aureus.

Fait important, les conditions microaérobies sont souvent rencontrées par S. aureus in vivo. En effet, lors d'une infection, les neutrophiles activés consommateurs d'énergie déclenchent une carence en oxygène, tandis que les macrophages, les cellules dendritiques et les lymphocytes T induisent une inflammation, altérant le flux sanguin vers les tissus et réduisant considérablement les niveaux d'oxygène38. De plus, des microenvironnements restreints en oxygène se forment lors d'infections associées à un biofilm39 ou d'abcès40. Par conséquent, au cours d'une infection, S. aureus est souvent exposé aux conditions environnementales décrites dans ce manuscrit et conduisant au développement de compétences pour la transformation génétique, renforçant le véritable potentiel de ce mode HGT in vivo. Cependant, notre analyse transcriptomique globale a également révélé que la transcription de nombreux gènes de virulence était réprimée lors du développement naturel de la compétence (Fig. 6). Ainsi, en tant que modèle in vivo, nous pouvons proposer qu'au cours d'une infection, les cellules de S. aureus induisent l'expression du régulon de virulence, ce qui conduirait à terme à une déficience locale en oxygène. Un pourcentage restreint de la population détecte alors ce signal environnemental et, en réponse, induit la compétence pour la transformation génétique dans une partie restreinte de la population. En fin de compte, les cellules compétentes de S. aureus répriment la virulence et favorisent l'HGT, tandis que le reste de la population continue de favoriser l'infection.

Les souches N3158, RN422041 et USA30042 de S. aureus, ainsi que les isolats cliniques43 utilisés dans ce projet, sont tous répertoriés dans le tableau supplémentaire 6. Les souches de S. aureus ont été cultivées dans du milieu BHI (Becton, Dickinson, and Company) ou dans un milieu entièrement synthétique. milieu appelé CS28, selon l'expérience. Si nécessaire, des antibiotiques ont été utilisés pour sélectionner des événements spécifiques (Kan, 200 µg/mL ; Cm, 10 µg/mL).

Les cellules ont été isolées à partir d'un stock à -80 ° C sur la plaque BHI. Quatre clones ont été inoculés dans 10 ml de BHI et incubés à 37 ° C sous agitation à 180 tr/min jusqu'à ce que la DO atteigne 2,5. Cette pré-culture a ensuite été centrifugée, lavée dans du milieu CS2 frais et utilisée pour inoculer 10 mL de milieu CS2 frais (DO = 0,5) dans des tubes Falcon fermés de 50 mL. À partir de cette culture CS2 initiale, des dilutions en série de 10 fois ont été effectuées pour générer 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 et 10-5 cultures fermées de tubes Falcon de 50 ml, et plus si nécessaire. Plusieurs tubes pour chaque dilution ont été préparés afin de prélever des échantillons individuels au cours de la croissance (c'est-à-dire que chaque tube Falcon n'a été ouvert qu'une seule fois pour un échantillon). Les dilutions ont finalement été incubées pendant une nuit à 37 °C sous agitation à 120 tr/min. Les cellules ont été collectées lorsque la DO était comprise entre 2 et 2,2 (souches rapporteuses GFP, Fig. 2 et 3) ou tout au long de la croissance (souches rapporteuses GFP, Fig. 1, mesures d'oxygène, Fig. 4).

Les promoteurs d'intérêt ont été insérés dans le plasmide pRIT-GFP44 en utilisant la méthode d'assemblage de Gibson. Les promoteurs et le plasmide pRIT-GFP ont d'abord été amplifiés avec des amorces dédiées. Tous les oligonucléotides utilisés dans cette étude sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 7. Dans la queue de chaque amorce, nous avons conçu des régions de chevauchement homologues de 25 à 50 pb entre les extrémités de chaque promoteur et le plasmide linéaire pRIT-GFP. Les promoteurs et le plasmide pRIT-GFP ont été amplifiés à l'aide de l'ADN polymérase haute fidélité Phusion (achetée auprès de Thermo Scientific). Tous les fragments PCR ont ensuite été purifiés à l'aide d'une colonne de silicium commerciale standard (kit de nettoyage PCR, Macherey-Nagen) et vérifiés par électrophorèse sur gel pour l'absence de fragments PCR non spécifiques ou mineurs.

Le mélange maître de l'assemblage Gibson a été préparé en ajoutant 320 µL de tampon ISO 5× (25 % p/v PEG-8000 ; 500 mM Tris-HCl, pH 7,5 ; 50 mM MgCl2 ; 50 mM DTT ; 5 mM NAD ; 1 mM chaque dNTP ), 0,64 µL d'exonucléase T5 10 U/µL, 20 µL de polymérase Phusion 2 U/µL, 160 µL d'ADN ligase Taq 40 U/µL et 699,36 µL d'eau (tous les réactifs ont été achetés auprès de New England Biolabs). Cinq microlitres du mélange de deux fragments d'ADN contenant 100 ng de plasmide pRIT linéaire et un excès de 3 fois d'inserts ont été ajoutés à 15 µL de mélange maître d'assemblage Gibson. Les tubes réactionnels sont ensuite incubés à 50°C pendant 1h. Enfin, 1 µL de la réaction d'assemblage a été transformé en cellules d'Escherichia coli électro-compétentes IM08B. Les cellules E. coli transformées ont été incubées à 37 °C sur de la gélose LB avec 100 µg/mL d'ampicilline.

Afin de sélectionner les transformants contenant le plasmide attendu, une PCR sur colonie a été réalisée. Les plasmides résultants ont été extraits de transformants positifs (cultures d'une nuit) et purifiés à l'aide d'un kit commercial (NucleoSpin Plasmid extraction kit, Macherey-Nagen). Tous les plasmides ont été vérifiés par séquençage (société GATC). Enfin, afin d'obtenir les souches rapporteuses finales, des cellules électrocompétentes de S. aureus ont été transformées avec chaque plasmide construit.

Afin d'étudier le rôle des principaux gènes supposés être impliqués dans la régulation du développement de la compétence chez S. aureus, répertoriés dans le tableau S1, des constructions de remplacement allélique ont été clonées dans le plasmide pIMAY sensible à la température44. Toutes les amorces utilisées pour le clonage dans la présente étude sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 7. Des fragments correspondant à des régions flanquantes de 1 kpb des gènes à supprimer ont été amplifiés à partir de l'ADN génomique de S. aureus N315 à l'aide d'amorces flanquées de sites d'enzymes de restriction compatibles avec le clonage multiple. site (MCS) de pIMAY. Les régions amont ou aval ont été digérées à l'aide des deux enzymes de restriction choisies et ligaturées dans le pIMAY, ouvert avec les mêmes enzymes. Les plasmides résultants ont été électro-transformés dans la souche IM08B E. coli. La PCR sur colonies a ensuite été utilisée pour vérifier la structure des plasmides présents dans les transformants. Les plasmides ont été purifiés à partir des colonies positives à l'aide d'un kit commercial (NucleoSpin Plasmid extraction kit, Macherey-Nagen). Après vérification de la séquence du plasmide (société GATC), la souche S. aureus N315ex woϕ a été transformée par électroporation et étalée sur gélose BHI additionnée de chloramphénicol (10 mg/mL) et incubée à 28 °C.

Afin de permettre l'intégration de pIMAY dans le chromosome, une seule colonie de la plaque de transformation a été remise en suspension dans 200 µL de BHI. La suspension a été diluée 10 fois jusqu'à 10-3 et 100 µL de chaque dilution ont été étalés sur du BHI additionné de chloramphénicol (10 mg/mL) et incubés à 37 °C pendant une nuit. Le lendemain, les colonies ont ensuite été striées dans les mêmes conditions. Pendant ce temps, une analyse par PCR de colonie a été effectuée pour vérifier l'absence de pIMAY extrachromosomique et si l'intégration du plasmide s'était produite dans la région en amont ou en aval.

Sur la base des résultats de la PCR de la colonie, une culture d'une nuit dans du BHI à 28 ° C sans chloramphénicol a été réalisée. La culture d'une nuit a ensuite été diluée 10 fois jusqu'à 10-7. Cent microlitres de dilutions 10-4 à 10-7 ont été étalés sur du BHI contenant 1 µg/mL d'anhydrotétracycline (aTc). Les plaques ont été incubées à 28 °C pendant 2 à 3 jours. Les colonies ont ensuite été patchées sur des plaques de BHI (sans antibiotique) et de BHI additionnées de chloramphénicol (10 mg/mL) et cultivées à 37 °C pendant la nuit. Les colonies sensibles au chloramphénicol ont été criblées par PCR de colonies pour identifier les clones contenant la mutation souhaitée. Les souches mutantes ont finalement été vérifiées par PCR et séquençage d'ADN.

Après croissance dans CS2, 500 µL de cellules ont été récoltées par centrifugation à 11 000 g pendant 1 min. Les culots ont été remis en suspension dans 500 µL d'éthanol froid à 70 % et incubés sur de la glace pendant 20 min afin de fixer les cellules. Ensuite, les cellules de S. aureus ont été remises en suspension dans 500 µL de PBS (pH 7,4) après centrifugation à 11 000 g pendant 1 min. Enfin, le pourcentage de la population exprimant la GFP a été évalué par cytométrie en flux (Cytoflex top-bench cytometer, Beckman-Coulter). Après la détection par diffusion avant et latérale pour identifier les cellules individuelles, un laser à 488 nm a été utilisé pour distinguer les cellules compétentes exprimant la GFP par comparaison avec l'autofluorescence d'une souche n'exprimant pas la GFP (St12) (voir la Fig. 1a supplémentaire). ).

Il est important de mentionner que la GFP est une protéine très stable. Par conséquent, une fois le pourcentage maximum de cellules compétentes atteint, ce nombre est resté constant pendant des heures. Cette caractéristique ne signifie pas que la compétence reste «ouverte» pendant des heures mais plutôt qu'une fois le maximum atteint, aucune nouvelle cellule compétente n'apparaît.

Après croissance dans CS2, les cellules ont été récoltées et traitées comme expliqué ci-dessus (voir cytométrie en flux). Des images de fluorescence des cellules ont été prises à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (plateforme ImagerieGif). La GFP a été excitée à 488 nm à l'aide du laser bleu et les images de fluorescence ont été collectées à l'aide du canal vert. Les images ont été reconstituées à l'aide du logiciel ImageJ.

La souche de type sauvage (St12) ainsi que les souches mutantes comGA (St137), comK1 (St37), comK2 (St38) et sigH (St45) ont d'abord été cultivées à la compétence en utilisant notre protocole de dilution optimisé. Nous avons choisi de réaliser les expériences de transformation en utilisant la culture de dilution -2 pour chaque souche. Les cellules ont été naturellement transformées en suivant le protocole précédemment publié8 avec quelques ajustements. En bref, à chaque instant (toutes les demi-heures), 2 ml de cellules ont été récoltées par centrifugation à 10 000 g pendant 1 min à 4 ° C, remises en suspension dans 2 ml de CS2 frais et divisées également en deux tubes. Un ou 5 µg d'ADN donneur (plasmide ou chromosome) ont été ajoutés à l'un des tubes (le second tube est utilisé comme contrôle « sans ADN ») et incubés à 37 °C pendant 2,5 h avec agitation à 180 tr/min. Dix ou 100 µL (tube avec ADN) ou 1 mL (« contrôle sans ADN ») de chaque tube ont finalement été mélangés avec 25 mL de gélose BHI fondue pré-refroidie à 55 °C avec un antibiotique, et le mélange a été versé dans Des boîtes de Pétri. Après solidification, les plaques ont été incubées à 37°C pendant 48h. À chaque instant, la viabilité a également été évaluée par dilution en série sur des plaques de gélose BHI. Les efficacités de transformation ont finalement été calculées en divisant le nombre de transformants détectés dans 1 ml de culture par le nombre total de cellules dans le même volume. Les nombres présentés sur la figure 1c représentent la moyenne des efficacités de transformation les plus élevées détectées au cours de la croissance au cours de chaque expérience. Les expériences ont été répétées pour chaque souche au moins 5 fois pour fournir une forte pertinence statistique.

Plasmide. Le plasmide pCN34 (Kan45) a été utilisé dans certaines des expériences de transformation génétique (Fig. 1c). pCN34 a été purifié à partir de la souche St197. Brièvement, 50 ml de culture ont été récoltés par centrifugation et le plasmide a été purifié à l'aide d'un kit de purification de plasmide (Macherey-Nagen).

ADN chromosomique. la souche St294 a été utilisée pour fournir l'ADN chromosomique du donneur (Fig. 1c, d). Dans St294, le plasmide pIMAY-INT14 (Cm) a été inséré dans le chromosome au site chromosomique INT14. L'insertion du plasmide a été vérifiée par PCR alors qu'aucun plasmide répliquant n'a pu être détecté. En bref, 100 mL de culture ont été centrifugés et remis en suspension dans 5 mL de TEG (Tris 5 mM, pH8 ; EDTA, 10 mM ; Glucose, 1 %) complété avec 500 μL de protéinase K (10 mg/mL), 2 mL de lyse tampon (NaOH, 0,2 N ; SDS, 1 %) et 20 g de billes de verre (Stratech, #11079-105, 0,5 mm de diamètre). Les cellules ont ensuite été cassées en utilisant 5 cycles de vortex (1 min chacun) avec 1 min dans la glace entre chaque cycle. Pour terminer la lyse cellulaire, 3 ml de tampon de lyse ont été ajoutés pendant 5 min à température ambiante et neutralisés avec 6 ml de NaAc (3 M, pH 4,8). Enfin, l'ADN chromosomique présent dans le surnageant a été précipité à l'aide d'éthanol à 96 % (1 ml d'EtOH pour 500 µL de surnageant) après 2 heures d'incubation à -20 °C. Après centrifugation, l'ADN chromosomique a été lavé avec 300 µL d'éthanol froid à 70 %. L'ADN chromosomique précipité a finalement été remis en suspension dans 300 µL de Tris 5 mM, pH8.

Échantillonnage et isolement. Des cultures de S. aureus ont été cultivées dans du milieu CS2 à 37 °C et 180 tr/min jusqu'à ce que la DO600 atteigne 2. Pour éteindre le métabolisme cellulaire/la transcription et pour stabiliser les ARN, les cellules ont été récoltées par centrifugation à 10 000 g pendant 1 min à 4 °C et les pastilles immédiatement congelées dans de l'azote liquide avant stockage à -80 °C. Trois répliques biologiques indépendantes ont été collectées pour chacune des quatre souches (type sauvage, St29 ; ΔcomK1, St40 ; ΔcomK2, St41 ; ΔsigH, St61). Pour l'extraction de l'ARN, les cellules ont été lysées à l'aide de la matrice de lyse B et d'un instrument FastPrep (tous deux MP Biomedicals), et l'ARN a été isolé à l'aide du kit RNeasy Mini (Qiagen). Les ARN ont été traités avec TURBO DNase (Ambion), purifiés à l'aide du protocole RNA Cleanup du RNeasy Mini Kit (Qiagen) et stockés à -80 ° C. L'intégrité de l'ARN a finalement été analysée à l'aide d'un Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies).

Déplétion d'ARNr, construction de bibliothèques et séquençage. Élimination de l'ARNr 23 S, 16 S et 5 S à l'aide du kit d'élimination de l'ARNr RiboZero (Epicentre) (deux fois), construction d'une bibliothèque spécifique à un brin produisant des fragments de taille comprise entre 100 et 500 pb, regroupement des 12 bibliothèques indexées, séquençage dans une voie de cellule d'écoulement sur un instrument Illumina HiSeq2000 avec un protocole d'extrémité apparié de 75 nt, et le démultiplexage des 12 échantillons de lectures indexées a été effectué par le "Next Generation Sequencing (NGS) Core Facility" de l'Institute for the Integrative Biology of the Cellule (I2BC, Gif sur Yvette, France).

Lire la cartographie et l'analyse de l'expression différentielle. L'expression différentielle de toutes les caractéristiques annotées a été évaluée à l'aide de l'environnement de programmation statistique R. L'expression différentielle a été déterminée entre les échantillons de souche de type sauvage (St29, n = 3) et chacun des 9 échantillons (chacun n = 3) dans lesquels sigH, comK1 ou comK2 étaient absents. Le résultat de l'analyse de l'expression différentielle est présenté dans les tableaux supplémentaires 2 à 5. Les gènes avec des valeurs P corrigées du taux de fausses découvertes (FDR) < 0,01 et un rapport d'expression différentielle supérieur à 2, 3 ou 5 ont été considérés comme significativement exprimés de manière différentielle et sont présentés.

Accessibilité des données. L'ensemble des données RNA-seq est compilé et accessible sous la soumission GEO GSE224932.

Isolement d'exoprotéines. Des cultures de S. aureus (type sauvage, St12 ; ΔsigH, St45 et ΔcomK2, St 38) ont été cultivées dans 10 ml de CS2 dans des tubes Falcon de 50 ml pendant 19,5 h. Les surnageants de culture ont été recueillis par centrifugation à 6000 tr/min pendant 10 min (4 ° C) pour éliminer les bactéries, suivie d'une filtration à travers un filtre de 0,22 µm pour éliminer les débris cellulaires. Les protéines des surnageants de culture ont été précipitées dans de l'acide trichloroacétique (TCA) à 20 % (v/v) à 4 °C pendant une nuit. Les protéines précipitées ont été sédimentées par centrifugation à 13 000 tr/min pendant 45 min (4 °C) et les culots ont été lavés avec de l'éthanol à 96 %. Les culots de protéines ont finalement été centrifugés à 13 000 tr/min pendant 30 min (4 ° C), l'éthanol restant a été éliminé et les culots ont été laissés sécher à l'air.

Profilage des exoprotéines. Les exoprotéines précipitées ont été remises en suspension dans 18 µl de PBS 1X et incubées pendant 30 min à température ambiante. Après addition de 20 µl de tampon Novex Tris-Glycine SDS 2X (ThermoFisher) et de DTT 1 M, les échantillons ont été incubés pendant 10 min à 95 °C. Les exoprotéines ont finalement été séparées dans un gel Tris-Glycine 4–12% (Invitrogen) et visualisées à l'aide de la coloration Coomassie.

Préparation d'échantillons d'exoprotéines et analyse LC-MS. Les bandes contenant l'ensemble de l'échantillon ont été coupées et soumises à une digestion à la trypsine dans le gel en utilisant des conditions standard comprenant la réduction et l'alkylation. Les peptides générés par la trypsine ont été analysés par nanoLC-MSMS à l'aide d'un système de chromatographie liquide nanoElute (Bruker) couplé à un spectromètre de masse timsTOF Pro (Bruker). Les peptides ont été chargés sur une colonne analytique Aurora (ION OPTIK, 25 cm × 75 m, C18, 1,6 m) et séparés avec un gradient de 0 à 35 % de solvant B pendant 100 min. Le solvant A était de l'acide formique à 0,1 % et de l'acétonitrile à 2 % dans de l'eau et le solvant B était de l'acétonitrile avec de l'acide formique à 0,1 %. Les spectres MS et MS/MS ont été enregistrés de m/z 100 à 1700 avec une plage de balayage de mobilité de 0,6 à 1,4 V s/cm2. Les spectres MS/MS ont été acquis avec le mode d'acquisition basé sur la mobilité des ions PASEF (Parallel Accumulation Serial Fragmentation) en utilisant un nombre de scans PASEF MS/MS défini sur 10.

L'analyse des données. Les données brutes MS et MSMS ont été traitées et converties en fichiers mgf avec le logiciel DataAnalysis (Bruker). Les identifications de protéines ont été effectuées à l'aide du moteur de recherche MASCOT (Matrix Science, Londres, Royaume-Uni) par rapport à la base de données S. aureus. Des recherches dans la base de données ont été effectuées en utilisant la spécificité du clivage de la trypsine avec deux clivages manqués possibles. La carbamidométhylation des cystéines a été définie comme une modification fixe et l'oxydation des méthionines comme une modification variable. Les tolérances aux peptides et aux fragments ont été fixées à 10 ppm et 0,05 Da, respectivement. Les protéines ont été validées lorsqu'elles ont été identifiées avec au moins deux peptides uniques. Seuls les ions avec un score supérieur au seuil d'identité et un taux de découverte de faux positifs inférieur à 1% (option leurre mascotte) ont été pris en compte. La quantification basée sur la spectrométrie de masse a été réalisée par quantification sans étiquette en utilisant la méthode de comptage spectral. Les valeurs totales de comptage spectral MS/MS ont été extraites du logiciel Scaffold (version Scaffold 4.11.1, Proteome software Inc, Portland, OR) filtrées avec une probabilité de 95 % et 0,1 % FDR pour les seuils de protéines et de peptides, respectivement. Pour l'analyse statistique, les valeurs manquantes apparaissant dans les ensembles de données de comptage spectral au niveau des protéines ont été imputées par une valeur constante fixée à 0,1. Afin de prendre en compte la variation intra-échantillon dans les ensembles de données de comptage spectral, un test bêta-binomial a été effectué sur la base d'analyses MS/MS en triple avec des valeurs P calculées à l'aide du package R 'ibb' (version 13.06, 61). Les protéines ont été filtrées sur une valeur P < 0,05 et un changement de facteur supérieur à deux.

Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE avec l'identifiant de jeu de données PXD040550 et 10.6019/PXD040550.

Les concentrations d'oxygène ont été mesurées à l'aide des spots de capteur d'oxygène SP-PSt3-SA23-D3-OIW (PreSens GmbH, Regensburg, Allemagne). Ces spots de capteur ont été fixés à la paroi interne de tubes Falcon de 50 ml avec de la colle silicone afin que les spots soient toujours immergés pendant les expériences (c'est-à-dire en dessous de la marque de 5 ml). Les tubes Falcon ont été fermés à T0 et sont restés fermés pendant toute l'expérience.

Les spots du capteur sont recouverts d'un revêtement sensible à l'oxygène où l'oxygène moléculaire éteint la luminescence d'un complexe de porphyrine métallique inerte immobilisé dans une matrice perméable à l'oxygène. Ce procédé garantit une haute résolution temporelle et une mesure sans dérive ni consommation d'oxygène.

La durée de vie de photoluminescence du luminophore dans le spot du capteur a été mesurée à l'aide d'une fibre optique polymère reliée à un compteur d'oxygène (Fibox 4 trace ; PreSens GmbH). La lumière d'excitation (505 nm) était fournie par une fibre de verre, qui transportait également le signal de fluorescence émis (600 nm) vers l'oxymètre. Brièvement, une mesure d'oxygène a été réalisée, à travers le plastique du tube Falcon, en rapprochant simplement la fibre optique du spot du capteur. A chaque instant, la concentration en oxygène a été mesurée trois fois et les résultats fournis représentent la moyenne de ces trois mesures. Dans nos expériences, la concentration en oxygène a été mesurée toutes les 30 min.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

L'ensemble des données RNA-seq est compilé et accessible sous la soumission GEO GSE224932. Les données de protéomique de spectrométrie de masse ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE avec l'identifiant de jeu de données PXD040550 et 10.6019/PXD040550. Toutes les autres données sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Les données sources sont disponibles sous forme de tableau de données supplémentaires.

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Nous remercions Kazuya Morikawa et Tarek Msadek pour avoir fourni des souches et des constructions de S. aureus et pour les discussions scientifiques. Nous tenons également à remercier les installations Imagerie-Gif de cytométrie en flux et de protéomique (SICaPS) (Institut de Biologie Intégrative de la Cellule, I2BC, Gif sur Yvette, FRANCE) pour leur aide et leur soutien. Nous reconnaissons également l'expertise en séquençage et en bioinformatique de l'installation de séquençage à haut débit I2BC, soutenue par France Génomique (financée par le programme national "Investissement d'Avenir" ANR-10-INBS-09).

Ce travail a été soutenu par une "Bourse Jeune Chercheur" de l'Agence Nationale de la Recherche à Nicolas Mirouze (ANR-18-CE35-0004 GenTranSa) et une bourse de doctorat du Chinese Scholarship Council (CSC) attribuée à Shi Yuan Feng.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Shi Yuan Feng, Yolande Hauck.

Université Paris-Saclay, CEA, CNRS, Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), 91198, Gif-Sur-Yvette, France

Shi Yuan Feng, Yolande Hauck, Fedy Morgene, Rosa Mohammedi et Nicholas Mirouze

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SYF : Conceptualisation, méthodologie, investigation ; YH : Conceptualisation, méthodologie, investigation ; FM : Conceptualisation, méthodologie, investigation ; RM : Méthodologie, investigation ; NM : Conceptualisation, supervision, rédaction—révision et édition, administration de projet et acquisition de financement

Correspondance à Nicolas Mirouze.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : George Inglis et Tobias Goris. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

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Réimpressions et autorisations

Feng, SY, Hauck, Y., Morgene, F. et al. La régulation complexe de la compétence chez Staphylococcus aureus dans des conditions microaérobies. Commun Biol 6, 512 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04892-1

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Reçu : 19 juillet 2022

Accepté : 28 avril 2023

Publié: 12 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04892-1

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